核酸的分子生物學(xué)檢測方法，如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR），能夠用于精準(zhǔn)地分析樣本中微生物的種類和豐度，但是難以區(qū)分微生物的存活狀態(tài)。傳統(tǒng)的用于檢測樣本中活細(xì)胞的方法都需要對樣本進(jìn)行培養(yǎng)，但是此類檢測方法存在一定的局限性，無法用于檢測一些難培養(yǎng)或是不可培養(yǎng)的活細(xì)胞。

疊氮溴化丙錠（Propidium monoazide，PMA）是一種能與DNA結(jié)合的光反應(yīng)染料，不具有細(xì)胞膜滲透性，無法穿透活細(xì)胞完整的細(xì)胞膜，只能選擇性地穿透死細(xì)胞受損的細(xì)胞膜。進(jìn)入細(xì)胞后，PMA會(huì)與DNA雙螺旋發(fā)生共價(jià)交聯(lián)，進(jìn)而阻礙死細(xì)胞中目標(biāo)DNA的PCR擴(kuò)增，如圖所示。

基于PMA的這一特性，通過對PMA處理過的樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測序分析，即可得知樣本中微生物的存活狀態(tài)。

qPCR 法選擇性的檢測活細(xì)菌和死細(xì)菌，可廣泛用于食品安全檢測PMA高效選擇和靈敏的檢測死細(xì)菌中存在的活菌數(shù)在許多實(shí)際應(yīng)用，包括安全檢查，食品，飲用水的質(zhì)量控制，醫(yī)療診斷等方面至關(guān)重要。傳統(tǒng)使用細(xì)菌培養(yǎng)的檢測方法，既費(fèi)時(shí)又不靈敏。建立在實(shí)時(shí)熒光定量qPCR上的檢測，是一個(gè)快速而高度敏感的替代方法。然而普通qPCR方法的分析結(jié)果并不能區(qū)分活死細(xì)胞。

定量 PCR 基本操作步驟

qPCR 法選擇性的檢測活細(xì)菌和死細(xì)菌，可廣泛用于食品安全檢測
添加 PMA 染料到樣品中，并在黑暗中孵育

? 暴露在冷光下，使 PMA 染料交聯(lián)到 DNA 上

? 裂解完整的細(xì)胞，提取 DNA

? 常規(guī)實(shí)時(shí)熒光定量 PCR PMA 高效選擇和靈敏的檢測死細(xì)菌中存在的活菌數(shù)在許多實(shí)際應(yīng)用，包括安全檢查，食品，飲用水的質(zhì)量控制，醫(yī)療診斷等方面至關(guān)重要。

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